Metode dezinfekcije kod AGMP – 4.dio
dr sc Zlatko Tomljanović
Ministarstvo poljoprivrede Republike Hrvatske
zlatko.tomljanovic@mps.hr
Dezinfekcija se najčešće provodi mehaničkim čišćenjem, te fizikalnim i kemijskim postupcima. Mehanički postupci, poput čišćenja, struganja i pranja, uklanjaju nečistoće i organsku tvar u kojoj su uklopljeni mikroorganizmi te na taj način olakšavaju postupak dezinfekcije . Naime, uočeno je da su mnogi dezinficijensi nedjelotvorni u prisutnosti nečistoća i organske tvari. Također, sredstva za čišćenje – detergenti, sapuni i prašci za ribanje smanjuju broj mikroorganizama i uklanjaju ih s površina i predmeta.
Fizikalni postupci dezinfekcije podrazumijevaju uporabu vlažne ili suhe topline te zračenja. Iako uporaba topline predstavlja jedan od najstarijih postupaka fizikalne dezinfekcije, postoje određene razlike u primjeni i očekivanom rezultatu dezinfekcije između vlažne i suhe topline. Tako, vlažna toplina brže djeluje u kraćem razdoblju i učinkovitija je u usporedbi sa suhom toplinom.
Spaljivanje košnica, pčelinjih zajednica te ostalog pribora, opreme i alata predstavlja učinkovit način sanacije AGMP. Međutim, opaljivanje plamenom potpuno uništava spore bakterije P. larvae samo na površinskim dijelovima drvenih košnica, dok značajan broj infektivnih spora ostaje aktivan u unutarnjim strukturama drveta. Rezultati provedenih suspenzijskih testova djelomice objašnjavaju zašto je otežana dezinfekcija unutarnjih struktura drveta. Naime, drvna vlakna ponašaju se poput organske tvari koja, već u koncentraciji od 2 %, znatno smanjuje učinak površinske dezinfekcije. Stoga su DOBBELAERE i suradnici (2001) pobili uvriježeno mišljenje pčelara da je metoda opaljivanja drvenih dijelova pčelarske opreme i pribora plamenom dovoljna dezinfekcijska mjera.
Primjena toplog zraka u pećnicama ili sušilima na temperaturi između 110 oC i 150 oC kroz trideset minuta pokazala se učinkovitom u dezinfekciji manjih predmeta i materijala, posebice ako toplina prodire do tri milimetra u dubinu (BEDNÁŘ i sur., 2009.). Isti autori navode da kuhanje u vodi pod normalnim pritiskom kroz trideset minuta uz dodatak 1 do 2 % natrijevog karbonata ili kuhanje u vodi pod pritiskom kroz dvadeset minuta uspješno uništava spore uzročnika AGMP.
LEWIS i MCINDOE (2004.) opisali su primjenu vodene pare pod umjerenim pritiskom i minimalnom temperaturom od 121 oC kroz petnaest minuta, odnosno, najvišom temperaturom od 134 oC tijekom tri minute. U tim uvjetima vodena para je suh i zasićen medij. Međutim, BEDNÁŘ i suradnici (2009.) navode uspješan učinak primijenjene vodene pare pod umjerenim pritiskom pri minimalnoj temperaturi od 110 oC tijekom 45 minuta za dezinfekciju okvira za košnice i manjih pčelarskih predmeta.
Postoji mogućnost uspješne primjene gama zračenja u dezinfekciji sporama bakterije P. larvae onečišćenog saća. No, visoka cijena tretiranja kao i potreba transportiranja zaraženog materijala u mjesto gdje se provodi gama zračenje čine ovu metodu neprikladnom za praktično pčelarstvo.
Kemijski postupci dezinfekcije uključuju uporabu različitih dezinficijensa čiji izbor ovisi o spektru mikroorganizma koji se želi uništiti, prisutnosti organske materije na površini, uvjetima okoliša i otrovnosti dezinficijensa za ljude, životinje i okoliš. Tako, aldehidi, halogeni spojevi i oksidansi pokazuju učinak na bakterijske endospore dok anorganske kiseline, alkalne soli i fenoli imaju ograničeni učinak. Primjena alkohola ne uništava bakterijske endospore. OKAYAMA i suradnici (1997.) utvrdili su visoku i brzu sporocidnu aktivnost glutaraldehida i natrijevog hipoklorita na spore bakterije P. larvae. Također, primjena 0,5 % vodene otopine natrijevog hipoklorita odnosno 1,1 % otopine kaustične sode uništavaju spore P. larvae .
BEDNÁŘ i suradnici (2009.) navode da se učinkovitost vodenih otopina kalij hidroksida, natrij hidroksida i natrij karbonata u koncentracijama od 2 do 6 % povećava pri temperaturama od 80 oC i više. Biocidnu učinkovitost dva komercijalno dostupna dezinficijensa, Disenfection for beekeeping i Virkon S na bakteriju P. larvae uspoređivali su KIRIAMBURI i suradnici (2021.). Učinak dezinficijensa promatran je u suspenziji spora P. larvae te na površini drva i stiropora koji su inokulirani sporama bakterije P. larvae. Disenfection for beekeeping pokazao je 100 % biocidni učinak na spore u suspenziji dok je Virkon S imao učinak između 87 i 88,6 % u istom mediju. Međutim, Virkon S je pokazao značajno bolji sporocidni učinak na P. larvae na stiroporu. Oba dezinficijensa imala su gotovo jednak, ali ipak slabiji dezinficijski učinak na drvu, a u usporedbi s učinkom na spore u suspenziji i na stiroporu.
Dezinfekcijski učinak blago kisele vode s hipokloričnom kiselinom i slabo zakiseljene vode s klorovodičnom kiselinom na spore bakterije P. larvae kao i njihovu učinkovitost na pojedine genotipove P. larvae istraživali su OHASHI i suradnici (2020.). Oba ispitivana dezinficijensa pokazala su snažan biocidni učinak u suspenzijskim testovima bez prisutnosti organske tvari. Tako je utvrđeno da blago kisela voda s hipokloričnom kiselinom u koncentraciji 10 do 30 ppm klora smanjuje broj spora P. larvae u saću mnogo učinkovitije nego voda. Pri tome se dezinfekcijski učinak smanjivao ako je saće bilo starije i onečišćeno organskom tvari, te kad se postupak provodio pri temperaturi od 4 oC. Znatno jači dezinfekcijski učinak pokazala je slabo zakiseljena voda s klorovodičnom kiselinom u koncentraciji od 600 ppm klora uz prisutnost organske tvari i pri nižim temperaturama. Dobiveni rezultati upućuju na zaključak da se oba dezinficijensa mogu koristiti za dezinfekciju pčelarske opreme, a izbor dezinficijensa i uspješnost postupka ovisi o stupnju onečišćenja saća i pojedinom genotipu bakterije P. larvae. Primjerice, djelovanje blago kisele vode s hipokloričnom kiselinom na spore bakterije P. larvae u suspenzijskim testovima i na saću bilo je znatno brže kod ERIC I nego kod ERIC II genotipa. Međutim, da bi se pokazala jasna povezanost između genotipova bakterije i osjetljivosti na dezinficijens, bilo je potrebno testirati barem nekoliko sojeva za svaki genotip.
HAKLOVA i suradnici (2003.) utvrdili su da je učinkovitost magnezij monoperoksiftalat heksahidrata, kao sastavnog dijela dezinficijensa „Dismozon“, na spore bakterije P. larvae znatno veća u usporedbi s otopinom kaustične sode pri sobnoj temperaturi. Rezultati provedenih istraživanja pokazuju da otopina jodoforma smanjuje broj spora P. larvae s 1×106 na 1×104 u laboratorijskim uvjetima, te se može koristiti povremeno i preventivno u pčelarskoj praksi. Također, zasad nije utvrđena oralna i/ili kontaktna otrovnost za pčele, kao niti mogući štetni učinak jodoforma na kvalitetu meda.
Rezultati nedavno provedenih istraživanja ukazuju na sporocidnu učinkovitost plina klornog dioksida (ClO2) na P. larvae u vodi i na površinama različitih materijala (MAHDI i sur., 2022.). Mehanizam djelovanja klornog dioksida na spore P. larvae još nije potpuno objašnjen, ali se vjeruje da ClO2 djeluje na aminokiseline, uzrokujući oksidativno oštećenje proteina koji su uključeni u klijanje spore. Međutim, to bi se trebalo potvrditi biokemijskim analizama strukture proteina, te elektronskom mikroskopijom utvrditi promjene u strukturi spora. Dobiveni rezultati pokazuju kako se plin klorni dioksid može koristiti u rutinskoj dezinfekciji pčelarskog alata i pribora. No, potrebne su visoke koncentracije plina izložene kroz duže vremensko razdoblje. Učinkovita razina plina je 645 do 811 ng / mL ClO2 tijekom 30 minuta, 191 do198 ng / mL tijekom jednog sata, 21 do18 ng / mL tijekom 2 sata i 7 do16 ng / mL ClO2 tijekom 4 sata. Za dezinfekciju površina, koncentracije od 214 do 245 ng / mL ClO2 tijekom jednog sata i 191 do 200 ng / mL ClO2 tijekom dva sata potpuno inaktiviraju spore bakterije P. larvae. Zbog zahtjevnog postupka fumigacije, potrebno je provesti daljnja istraživanja kako bi uporaba plina ClO2 ušla u rutinsku primjenu u pčelarstvu.
DINGMAN (2011.) je, koristeći iskustva HILGRENA i suradnika (2007.), istraživao djelovanje 23 % vodikovog peroksida i 5,3 % peroctene kiseline na spore bakterije P. larvae. Primijenio je vodenu otopinu vodikovog peroksida i peroctene kiseline u razrjeđenju od 1 : 250 i 1 : 500. Pri temperaturi od 25 oC broj bakterijskih kolonija smanjio se s 5 log veličine na 1 log veličinu tijekom 14 minuta, a u razrjeđenju 1 : 500, odnosno, tijekom 10 minuta u razrjeđenju 1 : 250. U slučaju veće količine spora bakterije P. larvae, vjerojatno bi trebalo duže izlaganje kako bi se broj bakterijskih kolonija smanjio ispod razine detekcije.
Također, na temelju zaključaka HILGRENA i suradnika (2007.) može se pretpostaviti da različite temperature pri postupku biocidnog tretmana P. larvae uzrokuju različito vrijeme za inaktivaciju spora.
Antibakterijski učinak organosilicijske kvartarne soli (alkoksilana) na spore i vegetativni oblik bakterije P. larvae istraživali su ÖZKIRIM i YALÇINKAYA (2011.). Utvrđeno je da alkoksilan inhibira klijanje spora i vegetativni rast bakterije P. larvae u laboratorijskim uvjetima. Također, tijekom pokusa nije utvrđena otrovnost za odrasle pčele držane u kavezićima pri laboratorijski kontroliranim uvjetima, prilikom, ni nakon izravnog prskanja 1 % vodene otopine alkoksilana. Stoga autori smatraju da je moguća uporaba 1 % vodene otopine alkoksilana u preventivne svrhe u proljeće i jesen radi zaštite pčelinjih zajednice od bakterijskih i gljivičnih infekcija pogodovanih visokom razinom vlage u košnicama. Naime, alkoksilan je nova vrsta kationskog surfaktanta s hidrofobnim skupinama koje sadrže silicij, a nastaje kao posljedica hidrolize kvarternih amonijevih spojeva. Pri tome visoke koncentracije kvartarnog amonij klorida narušavaju strukturu bakterijske stanične membrane dovodeći do lize stanice (VETTER i sur., 2009.).
Djelovanje pimarinske kiseline na spore bakterije P. larvae istraživali su SONG i suradnici (2020.). Utvrdili su da pimarinska kiselina uspješno djeluje na spore bakterije P. larvae s minimalnom inhibicijskom koncentracijom od 6,25 µg/mL na obogaćenoj Mueller – Hintonovoj hranjivoj podlozi (MYPGP) nakon 48 sati inkubacije. U agar difuzijskom testu izmjerena je zona inhibicije od 10 do 14 milimetara. Rezultati upućuju na zaključak da pimarinska kiselina vjerojatno inhibira stvaranje biofilma bakterije P. larvae te oštećuje plazmatsku membranu uzrokujući pri tome istjecanje sadržaja.
Antagonističko djelovanje različitih rodova bakterija iz vrsta Bacillus i Brevibacillus, na P. larvae i uzročnika vapnenastog legla (Ascosphaera apis) istraživali su BARTEL i suradnici (2019.). Naime, većina vrsta iz roda Bacillus kao i srodni rodovi proizvode široku paletu antimikrobnih spojeva poput peptida, lipopeptida, bakteriocina i inhibitore slične bakteriocinu. Utvrđeno je da antagonistički odgovor ovisi o mediju, pripadnosti soju te je specifičan za vrstu. Molekularnim alatima istražena je prisutnost i distribucija homolognog slijeda devet gena koji kodiraju sintezu antimikrobnih peptida u sojevima antagonista. Lančanom reakcijom polimerazom utvrđena je prisutnost peptida bacilomicina L, fengicina, bacilizina, subtilina, iturina A i surfaktina. Njihova raspodjela i učestalost unutar bakterijskih antagonista je promjenjiva i ovisi o soju. Tako su najčešći surfaktini, iturini i bacilizini. Nadalje, utvrđena je korelacija između prisutnosti gena antimikrobnog peptida i gena antagonističkog djelovanja. Naime, 85 % antagonista sadržavao je barem jedan od antimikrobnih peptidnih gena. Također, utvrđena je povezanost između antagonističkog djelovanja pojedinih peptida i određenog genotipa bakterija P. larvae. Primjerice, većina sojeva bakterije Brevibacillus laterosporus sadrži gene za sintezu peptida subtilina i surfaktina te pokazuje izrazito antagonističko djelovanje na genotipove bakterije P. larvae ERIC I i ERIC IV. Međutim, djelovanje istih sojeva na ERIC II je gotovo beznačajno.
IORIZZO i suradnici (2020.) istraživali su utjecaj bakterije Lactiplantibacillus plantarum na P. larvae. Pet sojeva L. plantarum (P8, P25, P86, P95 i P100) djelovalo je antagonistički na bakteriju P. larvae ATCC 9545. Pri tome su spomenuti sojevi pokazali prikladna fizikalna i biokemijska svojstva (hidrofobnost, autoagregacija, proizvodnja egzopolisaharida, osmotska tolerancija, enzimska aktivnost i asimilacija ugljikohidrata) za njihovu upotrebu kao probiotika u prehrani pčela i otvorili mogućnost novih strategija u bio-kontroli AGMP. Međutim, potrebna su daljnja istraživanja u svezi sastavnica egzopolisaharida i njihove uloge u inhibiciji klijanja spora, tvorbi biofilma i vegetativnom rastu bakterije P. larvae. Također, dobiveni rezultati ukazuju da svojstva hidrofobnost i autoagregacija ovise o soju, a ne o vrsti bakterije pa je odabir i dostupnost novih bakterija s funkcionalnim osobitostima i antagonističkim djelovanjem protiv bakterije P. larvae uvjet za buduću praktičnu primjenu u pčelarstvu.
Inhibitorni učinak indolovih analoga na bakteriju P. larvae istraživali su ALVARADO i suradnici (2017.). Pri tome su koristili rezultate prethodnih istraživanja u kojima su utvrdili da u laboratorijskim uvjetima l-tirozin i mokraćna kiselina potiču klijanje, dok fenol i indol inhibiraju klijanje spora bakterije P. larvae (ALVARADO i sur., 2013.). U pokusu je potvrđeno da indoli, supstituirani halidima, inhibiraju klijanje spora P. larvae u laboratorijskim uvjetima te sprječavaju pojavnost AGMP na ličinkama pčela uzgojenim u laboratorijskim uvjetima. Također, indoli nisu toksični niti za vegetativne oblike bakterije P. larvae ni za ličinke pčela. Najbolji se pri tome pokazao 5-klorindol. Dobiveni rezultati upućuju na mogućnost razvoja jeftinog, lako primjenjivog i neotrovnog načina kontrole i suzbijanja AGMP.
povezane novosti:
Foto: MALIŠANIMA ODRŽANA EDUKATIVNA RADIONICA O PČELARSTVU
Danas je, u vrtiću "Dvor", održan slovenački doručak a tokom kojeg je mališanima predškolskog uzrasta održana edukativna radionica o pčelarstvu. Edukativno predavanje održ
Samo za vrijedne pčelare | Pčelarski radovi tokom narednog perioda
Vrlo je važno oboriti što više varoe kako bi u proljeće društva ušla čista.